[发明专利]一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的引物对及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)的引物对及其应用，属于生物技术领域。所述引物对包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为：5’‑TTCACCGACTACACCAGTGC‑3’；5’‑CATCAGTTCGTAGTGGCGGT‑3’。本发明提供的引物对特异性好且灵敏度高，能够特异性扩增出西瓜细菌性果斑病菌特有的基因片段，利用该引物对实现对西瓜细菌性果斑病菌的准确鉴定，对西瓜细菌性果斑病菌DNA的最低检测浓度达到40pg/μL。利用本发明提供的检测方法可以快速准确鉴定西瓜样品中的西瓜细菌性果斑病菌，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测和鉴别西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)的引物对及检测方法。

背景技术

西瓜是传统的夏令水果，我国作为世界上西瓜种植面积最大的国家，一直将其作为种植业结构调整中优先发展的主导产品，西瓜产业的健康发展在促进农民增收、调节茬口布局、丰富果品市场等方面具有重要的作用，近年来随着生活水平的提高，种植户和消费者也越来越关注瓜果的品质等问题。

西瓜细菌性果斑病于1987年首次在美国发现，此后在世界范围内广泛发生。近年来，我国有20多个省和自治区 受到了西瓜细菌性果斑病的侵染，山东、宁夏、内蒙古和新疆更成为了果斑病发生的重灾区，由于该病害发生危害大、损失重，对我国的西瓜产业存在着巨大的威胁，所以我国已将其列为重要的进境检疫性有害生物和全国农业植物检疫性有害生物，西瓜细菌性果斑病的防控已成为国内外西瓜生产上亟待解决的突出问题。

西甜瓜细菌性果斑病病原为Acidovorax citrulli，它可以侵染多种葫芦科作物，如西瓜、甜瓜、南瓜、黄瓜等，造成蔬果减产甚至绝收。初侵染源主要有种子带菌、其他植物病残体和土壤病残体等，病原菌可以通过灌溉、机械以及农事操作进行传播扩散，种子带菌是病原菌传播最主要的方式，病菌在西瓜种子上可存活19年，目前针对该病原菌无有效的防治方法和抗病品种。

目前，西瓜细菌性果斑病的检测主要以基于聚合酶链式反应(PCR)的分子生物学检测为主，如常规PCR、荧光定量PCR、免疫PCR等，PCR 检测的可靠性对于明确病原菌的种类，监测病原菌的分布，预警病害的发生和流行以及有效的病害防控至关重要，因此，需要设计高度特异的引物来确保PCR检测结果的准确性。21世纪以来，随着基因组学的快速发展和西瓜细菌性果斑病的日趋严重，许多研究开始基于西瓜嗜酸菌 (Acidovorax citrulli)的16S rRNA基因和ITS序列设计引物，但是由于西瓜嗜酸菌16S rRNA基因和ITS序列在嗜酸菌属内有很高的同源性，并不能完全区分开西瓜嗜酸菌和其近缘种，导致设计的引物特异性较低，在检测中常常出现假阳性；还有一些针对细菌的功能基因设计的引物，如针对Acidovorax citrulli的HRP(Hypersensitivereaction and pathogenicity gene)基因设计的引物HB2F2/HB2R2，但是这对引物不能区分西瓜细菌性果斑病菌和嗜酸菌属的另2个种(Acidovorax avenae；Acidovorax cattleyae)；针对 Acidovorax citrulli的YD-repeatprotein设计的引物AC158F/AC158R不能区分有效的区分Acidovorax citrulli和Acidovorax avenae；针对Box-PCR 产物设计的引物BX-L1/BX-S-R2和BoxAACF/BoxAACR2虽然在特异性方面优于其他引物，但不能完全区分开Acidovorax citrulli和Acidovoraxavenae的一些菌株。

综上，为了防止交叉反应，准确的对西瓜细菌性果斑病进行检测，还需要进一步加强设计引物的专化性和灵敏度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够准确鉴定和检疫西瓜细菌性果斑病菌的方法，以克服现有PCR方法检测西瓜细菌性果斑病菌存在的引物特异性低或通用性低、检测易出现假阳性或假阴性的缺点。