[发明专利]一种通过多糖絮凝剂处理收集微藻制备生物柴油的方法

权利要求书

1.一种微藻的絮凝方法，其特征在于，包括以下步骤：将微藻培养至一定浓度得到微藻培养液，添加多糖絮凝剂，使微藻絮凝沉降。

2.根据权利要求1所述的一种微藻的絮凝方法，其特征在于：

微藻培养包括以下步骤，将微藻种子液培养到对数生长期，接种到新鲜的BG11培养基内，微藻种子液和新鲜培养基的体积比为1:5～1:9，培养温度为25-30℃，培养光照条件为2000-3000LX，培养时间为7-15天直到生长平台期，所述微藻为小球藻或铜绿微囊藻；

微藻絮凝沉降包括以下步骤，称取多糖絮凝剂，所述多糖絮凝剂为右旋糖酐-甜菜碱阳离子絮凝剂粉末，将多糖絮凝剂溶于蒸馏水中配制成浓度为1g/L的右旋糖酐-甜菜碱阳离子絮凝剂母液，取适量微藻培养液，调节pH至2-8，在40-80r/min的搅拌速度下，加入终浓度1-15mg/L的右旋糖酐-甜菜碱阳离子絮凝剂，继续搅拌5-15min后静置10-100min，即得絮凝的微藻。

3.一种通过多糖絮凝剂处理收集微藻制备生物柴油的方法，其特征在于：利用权利要求1或2任一项所述的微藻的絮凝方法将微藻絮凝沉降，然后将微藻烘干研磨成藻粉，使用甲醇和石油醚分步提取微藻中的油脂得到微藻油脂，以脂肪酶为催化剂，加入碳酸二甲酯进行酶催化反应，即得到生物柴油，其中，微藻为小球藻。

4.根据权利要求3所述的一种通过多糖絮凝剂处理收集微藻制备生物柴油的方法，其特征在于：微藻烘干温度为40-50℃。

5.根据权利要求3所述的一种通过多糖絮凝剂处理收集微藻制备生物柴油的方法，其特征在于，使用甲醇和石油醚分步提取微藻中的油脂具体包括以下步骤：称取一定量的藻粉，加入甲醇重悬藻粉，利用超声破碎将细胞充分破坏，然后水浴保温，离心转移上清；再加入石油醚重悬藻粉，水浴保温，离心转移上清；将得到的两种上清液混合，并加入等量体积的水，摇匀后静置，收集上层石油醚层，蒸干石油醚，即得到微藻油脂。

6.根据权利要求5所述的一种通过多糖絮凝剂处理收集微藻制备生物柴油的方法，其特征在于：甲醇与藻粉的比例为5:1-20:1v/w，超声破碎的功率为在200-250W，超声破碎的时间为20-30min；石油醚与藻粉的比例为5:1-20：1v/w；水浴温度均为30℃，水浴保温时间均为4-6h，石油醚的蒸干温度为40-50℃。

7.根据权利要求3所述的一种通过多糖絮凝剂处理收集微藻制备生物柴油的方法，其特征在于：所述脂肪酶为梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。

8.根据权利要求7所述的一种通过多糖絮凝剂处理收集微藻制备生物柴油的方法，其特征在于，所述梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的制备方法包括以下步骤：

(1)以来源于梳棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶基因GeneBank:ABV69591.1为模板，将该酶命名为TLL291，以KpnI-XbaI为克隆位点将其插入到pPICZαA载体中，通过PCR扩增技术，得到重组表达质粒pPICZαA-TLL291，将重组表达质粒转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中，经过博来霉素抗性筛选、酶切、电转化和SDS-PAGE验证后获得能够稳定表达脂肪酶TLL291的基因工程菌；

(2)使用步骤(1)中构建的脂肪酶基因工程菌种子液按照1％v/v接种量转接到YPD培养基中培养24h，然后转接入BMGY培养基中培养24h，收集菌体重新分散于BMMY培养基中，每24h添加0.5％-2％v/v的甲醇进行诱导培养，诱导培养72-120h后，离心除去菌体，即可得到脂肪酶，将酶液离心超滤浓缩备用。

9.根据权利要求8所述的一种通过多糖絮凝剂处理收集微藻制备生物柴油的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，整个培养过程维持220r/min、28℃。

10.根据权利要求3所述的一种通过多糖絮凝剂处理收集微藻制备生物柴油的方法，其特征在于：所述微藻油脂与碳酸二甲酯摩尔比为1:2-1:8，脂肪酶添加量终浓度为100-200μg/mL，在30-50℃、220r/min摇床中反应48-96h。