[发明专利]一种用于固态酿造食醋发酵过程的生物强化技术

摘要

本发明公开了一种用于固态酿造食醋发酵过程的生物强化技术，属于生物工程技术领域。本发明的操作方法流程为：(1)酿醋功能性微生物的确定：采用PCR-DGGE等分子生态学技术解析固态酿造食醋醋醅中微生物群落的结构，结合与食醋产品品质和功能性相关的关键理化指标确定食醋酿造过程的功能性微生物；(2)酿醋功能性微生物菌株的纯培养：采用微生物纯培养技术从食醋醋醅中获得酿醋功能性微生物菌株；(3)食醋发酵过程的生物强化：选用食醋酿造功能性微生物菌剂或其组合，在食醋固态发酵阶段进行生物强化。该方法具有缩短食醋酿造周期、改善并控制食醋产品风味品质及功能性、提高原料利用率等优点。

主权项

一种用于固态酿造食醋发酵过程的生物强化技术，其特征在于酿醋生物强化技术按以下步骤进行：(1)醋醅微生物群落总DNA的提取。选择正常发酵过程的醋醅2g，采用液氮研磨、溶菌酶处理、氯仿‑异戊醇抽提、乙醇洗涤、RNaseA消化等步骤提取基因组DNA。(2)合成引物并利用PCR扩增技术，扩增出细菌16S rDNA V3区序列。(3)利用电泳仪对扩增的16S rDNAV3片段进行DGGE分析。其条件为：8％聚丙烯酰胺凝胶，30％～50％变性梯度(100％变性剂浓度为7M尿素，40％甲酰胺)，上样量为200ng，缓冲液为1×TAE，60℃，200V电压电泳4h，SYBRGreen I染色45min。(4)优势微生物的序列测定。选择DGGE胶上10～20个最为显著的条带，切割胶条，并进行序列分析，在GenBank中进行BLAST比对，初步确定优势微生物的种属。(5)功能性微生物筛选。利用醋酸菌、乳酸菌发酵培养基培养基，以醋醅为筛选样品，筛选醋醅中醋酸菌、乳酸菌等微生物。挑选生长较快、分布密度较大但菌落形态不同的20～30株菌落，纯化后保存。(6)功能性微生物的确定。对上述筛选获得的纯培养微生物进行16S rDNA测序，测序结果与DGGE获得的优势微生物进行比较，选择2～5株优势微生物用于生物强化。若本步骤未获得优势微生物，则按照功能性微生物筛选方法进行重复筛选和鉴定。(7)生物强化菌株的预培养，采用斜面、三角瓶、一级种子、二级种子扩培方法，对生物强化的菌株进行扩大培养，培养至对数生长期。(8)醋酸发酵过程的生物强化。将上述培养的菌株种子液，按照固体发酵培养基的1～2％的接种量，于醋酸发酵开始的1～7天进行接种，其中强化所用的醋酸菌直接添加到醋醅的表面，而乳酸菌拌入到培养基底部。生物强化每批次可进行1～3种微生物的强化，可以同时开展，也可以分开进行，其最优强化方案应根据效果进行选择。