[发明专利]一种苯丙氨酸单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明涉及一种苯丙氨酸单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：步骤S1:备置纯度≥95%的半抗原D‑Phe，并备置纯度≥95%的筛选原L‑Tyr及L‑Try；步骤S2：免疫原制备；步骤S3：动物免疫；步骤S4：细胞融合和筛选；步骤S41：初筛；步骤S42：复筛；步骤S43：竞争ELISA检测；步骤S44:阳性克隆的扩大培养和冻存；步骤S5：亚克隆；步骤S6：抗体生产。本发明用一种大分子物质与苯丙氨酸偶联，使之有抗原性，免疫小鼠，与鼠骨髓瘤细胞（sp2/0）融合，制备杂交瘤细胞，筛选和制备苯丙氨酸的单克隆抗体，可靠性好，用于试纸条的加工品质高，通过采集新生儿尿液以试纸法来筛查苯丙酮尿症。

主权项

1.一种苯丙氨酸单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：/n步骤S1: 备置纯度≥95%的半抗原D-Phe，并备置纯度≥95%的筛选原L-Tyr及 L-Try；/n步骤S2：免疫原制备，将半抗原和筛选原分别与OVA和BSA偶联，制成D-Phe-OVA、D-Phe-BSA、L-Tyr -OVA、L-Tyr- BSA、L-Try -BSA和L-Try- OVA；/n步骤S3：动物免疫，分别设置A组和B组，其中A组5只Balb/c小鼠，用D-Phe-OVA免疫，然后用D-Phe-BSA检测；B组5只Balb/c小鼠，用D-Phe-BSA免疫，然后用D-Phe-OVA检测，免疫7天后，用间接ELISA和竞争ELISA方法检测免疫动物血清，确定免疫应答水平；/n步骤S4：细胞融合和筛选，将步骤S3符合免疫应答水平要求的动物免疫细胞与鼠骨髓瘤细胞sp2/0进行细胞融合；/n步骤S41：初筛，用间接ELISA方法筛选融合细胞培养上清液，挑选出能产生抗苯丙氨酸抗体的阳性克隆；/n步骤S42：复筛，对初筛得到的能产生抗苯丙氨酸抗体的所有阳性克隆，进行复筛确认；/n步骤S43： 竞争ELISA检测，将经复筛确认的能产生抗苯丙氨酸抗体的所有阳性克隆进行竞争ELISA检测；/n步骤S44:阳性克隆的扩大培养和冻存，将上述阳性克隆细胞转到24孔板扩大培养，每个扩大培养的克隆收集2ml以上的上清液，用于间接ELISA和竞争ELISA检测，冻存能产生抗苯丙氨酸特异性抗体的阳性克隆细胞；/n步骤S5：亚克隆，采用有限稀释法对上述阳性克隆进行亚克隆，以获得单克隆细胞，用间接ELISA和竞争ELISA方法进行亚克隆筛选，每个阳性克隆选择至少2个稳定的子克隆进行扩增和低温保存；/n步骤S6：抗体生产，分别对亚克隆筛选的单克隆细胞进行抗体生产，采用ProteinA/G亲和层析方法纯化抗体，用透析方法将纯化抗体保存在磷酸盐缓冲液中。/n