[发明专利]一种抗氯胺酮杂交瘤细胞株及其制备方法和应用

权利要求书

1. 一种抗氯胺酮杂交瘤细胞株，其特征在于该抗氯胺酮杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株3E7.1，于2012年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:C2012157；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。

2.如权利要求1所述的抗氯胺酮杂交瘤细胞株作为分泌抗氯胺酮单克隆抗体的应用，分泌出的抗氯胺酮单克隆抗体属于IgG1亚型，轻链是kappa链。

3.制备如权利要求1所述的抗氯胺酮杂交瘤细胞株并分泌抗氯胺酮单克隆抗体方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤(1).氯胺酮人工抗原的制备：

1-1.氯胺酮半抗原的制备：以盐酸氯胺酮为原料，游离后与溴乙酸乙酯进行取代反应引入酯基，得到氯胺酮的酯，然后在碱性条件下水解得到含羧基的氯胺酮半抗原：

1-2.氯胺酮人工抗原的制备：通过碳二亚胺法使氯胺酮半抗原与牛血清蛋白(BSA)结合制备氯胺酮人工抗原，即氯胺酮-牛血清蛋白：

步骤(1)的反应过程如下：

；

步骤(2).小鼠免疫：

选择8周龄的BALB/c雌鼠用氯胺酮人工抗原注射靠近淋巴结皮下部位进行免疫；

所述的靠近淋巴结皮下部位为四肢腋下、四肢前臂或颈部；

步骤(3).淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合：

3-1.饲养细胞制备：小鼠摘眼球处死，浸泡于75﹪酒精中消毒，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，注入37℃预热的IMDM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；离心，沉淀物用1×HAT的IMDM培养液重悬，得到饲养细胞悬液；

3-2.小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为10﹪FBS的IMDM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长状态良好用于细胞融合；

3-3.淋巴细胞制备：取经步骤(2)处理的BALB/c雌鼠靠近淋巴结皮下部位的淋巴结，研磨淋巴细胞至悬液；淋巴细胞悬液离心，取沉淀；在沉淀中加入IMDM培养基，调整淋巴细胞的浓度至1×10⁷个/mL；

3-4.淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合：采用聚乙二醇融合法；将调整浓度后的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞个数比为2：1混合均匀，离心洗涤细胞，去除上清液，置于37℃水浴，加入1mL 37℃预温的PEG 1450，加入25ml 37℃预温的IMDM无血清培养基终止PEG作用；离心，取沉淀；然后在沉淀中加入步骤3-1的饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5﹪CO₂培养箱中培养；

步骤(4).杂交瘤细胞的筛选：

4-1.初筛：

融合细胞在5﹪CO₂培养箱中培养3天后，换用1×HT的IMDM培养液继续培养4天后，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆；

所述的细胞团簇在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小占满1/3视野；

所述的1×HT的IMDM培养液含有体积分数为15﹪的FBS；

4-2.复筛：

将筛选到的阳性克隆进一步的用竞争抑制ELISA方法进行复筛，筛选出竞争抑制率最高的杂交瘤细胞株3E7做克隆培养；

4-3.杂交瘤细胞株3E7的克隆化：

杂交瘤细胞株3E7的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含体积分数为15﹪FBS的IMDM培养基稀释成4个/mL的细胞悬液，然后以每孔200ul稀释后的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况，并检测细胞培养板中细胞培养上清液的抗体水平，选择3个抗体效价最高的单克隆，做再次克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率达到100﹪；然后挑取单克隆细胞，命名为3E7.1，扩大培养后进行抗氯胺酮单克隆抗体纯化；

步骤(5).抗氯胺酮单克隆抗体纯化：

将筛选到的单克隆细胞株3E7.1用含体积分数为10﹪FBS的IMDM培养基接种到24孔细胞培养板中，第二天接种到细胞培养瓶中，培养1天后，接种到细胞滚瓶中，滚瓶培养4天后，收集培养上清液，将培养上清液浓缩后得到含有抗氯胺酮单克隆抗体的细胞培养浓缩液，然后用HiTrap PROTEIN G HP亲和柱纯化，得到纯化后的抗氯胺酮单克隆抗体；

所述的PBS缓冲液为含有0.008M十二水磷酸氢二钠、0.15M氯化钠、0.002M二水磷酸二氢钠的水溶液，pH为7.4；

所述的1×HAT的IMDM培养液含有体积分数为15﹪的FBS。