[发明专利]一种制备甲型流感病毒全长M2蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种制备甲型流感病毒全长M2蛋白的方法，属于生物技术领域。本发明采取原核表达系统，融合了纯化标签，结合了不同裂解剂的性质进行抽取，通过规模表达、提取和亲和纯化，使M2蛋白纯度达98%以上并具有生物活性（非包涵体形式，可溶性），采用15升的发酵罐进行发酵可得1～1.5mg的M2蛋白，可满足M2蛋白结构与功能的研究，如X-ray、质谱，也满足M2蛋白为基础的生物制备研究，如疫苗、治疗性抗体、诊断试剂等。

主权项

一种制备甲型流感病毒全长M2蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）合成甲型流感病毒全长M2蛋白基因；（2）基因合成后，插入克隆质粒；（3）根据甲型流感病毒全长M2蛋白基因序列，设计用于扩增甲型流感病毒全长M2蛋白基因的引物，在上游引物的3’端引入BamHI酶切位点，在下游引物的3’端引入HindⅢ酶切位点及6个组氨酸标签序列，以合成的甲型流感病毒全长M2蛋白基因为模板扩增甲型流感病毒全长M2蛋白基因，产物与用同样酶切后的pMAL‑p2X表达质粒片段连接；（4）连接产物转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序，得到pMAL‑p2X MBP‑M2‑6×His重组质粒；（5）重组质粒pMAL‑p2X MBP‑M2‑6×His接种LB培养基，按1:2000~1:300（V/V）转接到含有10L LB培养基的15L的发酵罐中，以200rpm转速37℃培养4~6h，菌液OD600达到0.5~0.6时，接种浓度0.5~0.7mmol/L加入IPTG诱导4h，4000rpm离心40min，获得细菌培养物25~30g；（6）细菌膜蛋白提取和纯化a细菌膜蛋白提取将步骤（5）得到的细菌培养物在冰浴中完全融化，重悬于层析平衡液中，超声破碎后以100,000g离心1h分离上清和沉淀，沉淀重悬于层析平衡液，加入不同的裂解剂在4℃搅拌2h提取膜蛋白，测定提取物的活性，以确定总蛋白和裂解剂的比例，提取物以100,000g离心1小时，获得可溶性上清，再用层析平衡液稀释至最终裂解物的浓度为1.0%（w/v）以便于后续纯化；其中，所述的层析平衡液中含有20mmol/LTris,0.2mol/L NaCl,1mmol/L2‑巯基乙醇，1mmol/L EDTA以及20‑120ml/L蛋白酶抑制剂，pH8.0；其中，所述的裂解剂为1%Triton‑X100;b麦芽糖结合蛋白‑M2纯化在4℃条件下，10ml Amylose介质装柱、用三倍柱床体积含1.0%（v/w）Triton‑X100平衡液平衡，以1ml/min的速度进行虹吸上样，上样后用10倍柱床体积含1.0%（v/w）Triton‑X100平衡液冲洗，再用三倍柱床体积不含裂解剂的平衡液冲洗，用含10mmol麦芽糖的平衡液洗脱，分步收集，测定蛋白含量、纯度和活性；c酶切和纯化按75‑100ug蛋白加入1单位的Xa因子常温反应36‑48h，使酶切程度达到90‑95%，酶切后样品经缓冲液1(50mmol Sodium phosphate pH8.0,0.3mmolNaCl)充分透析，移入15ml离心管和已经平衡Ni+介质2ml在4℃条件下旋转混合4h，在常温以4000r/min离心1min除去上清，用缓冲液1充分洗涤，含0.25mmol/L咪唑的缓冲液1洗脱，即得。