[发明专利]自噬基因MAP1LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中的表达方法在审
| 申请号： | 201910872771.2 | 申请日： | 2019-09-16 |
| 公开（公告）号： | CN110564840A | 公开（公告）日： | 2019-12-13 |
| 发明（设计）人： | 赵振群;刘万林;白锐;龚瑜林;赵爱青;王文选;孟晨阳 | 申请（专利权）人： | 内蒙古医科大学第二附属医院 |
| 主分类号： | C12Q1/6883 | 分类号： | C12Q1/6883;G01N33/68 |
| 代理公司： | 11496 北京君泊知识产权代理有限公司 | 代理人： | 王程远 |
| 地址： | 010030 内蒙古自治*** | 国省代码： | 内蒙;15 |
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| 摘要： | 一种自噬基因MAP1LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中的表达方法，使用激素诱导出激素性股骨头缺血坏死动物模型，检测激素对骨细胞、成骨细胞MAP1LC3的mRNA与蛋白高表达影响；探讨3‑甲基腺嘌呤，调控骨细胞、成骨细胞自噬型死亡以及骨细胞、成骨细胞MAP1LC3的mRNA与蛋白高表达，显示第一、二、三、四周时：B组的MAP1LC3 mRNA呈高表达,C组中骨细胞的MAP1LC3 mRNA表达量较B组均降低。第一、二周B组中MAP1LC3蛋白高表达,C组中MAP1LC3蛋白表达明显下降。免疫荧光染色:B组中骨细胞、成骨细胞的GFP‑LC3融合蛋白表达均较对照组升高，C组GFP‑LC3融合蛋白表达明显下降。激素导致SANFH模型中骨细胞、成骨细胞的自噬型细胞死亡；导致骨细胞、成骨细胞的MAP1LC3的mRNA与蛋白高表达。3‑MA抑制骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡。 | ||
| 搜索关键词： | 成骨细胞 骨细胞 高表达 蛋白 股骨头缺血坏死 融合蛋白 细胞死亡 激素性 激素 免疫荧光染色 甲基腺嘌呤 蛋白表达 动物模型 激素诱导 对骨 升高 细胞 基因 检测 调控 死亡 | ||
【主权项】：
1.一种自噬基因MAP1LC3在家兔激素性股骨头缺血坏死中的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一、选健康5月龄新西兰大耳白兔36只，体重2.0-2.5kg，雌雄不限，标准饮食，单笼饲养；随机分成3组，A组12只，为对照组，单纯肌肉注射生理盐水，2ml/只/次，共4次，间隔一周；B组12只，肌肉注射甲基强的松龙，4mg/kg，共4次，间隔一周；C组12只，肌肉注射甲基强的松龙，4mg/kg，共4次，间隔一周，并于注射甲基强的松龙后随即肌肉注射3-MA2μl/只，共4次，间隔一周；分别将每组实验动物于一周、二周、三周、四周后采用空气栓塞法处死，每次处死3只；/n步骤二、无菌条件下取出实验动物双侧后肢的股骨头：一侧股骨头分成两部分：①一部分经40﹪中性甲醛固定、脱水、15％EDTA脱钙、梯度酒精脱水，浸蜡包埋，制成5um厚切片,HE染色后光镜观察用；②另外一部分经5﹪戊二醛溶液固定,于股骨头软骨下0.2-0.3cm切取1mm×1mm×1mm大小骨块，5％硝酸脱钙2-3h，1％四氧化锇后固定1h，梯度酒精脱水，EPON812(环氧树脂)包埋，包埋剂与无水乙醇分别以1：1、2：1、3：1浓度混合逐层置换无水乙醇，包埋，37℃恒温箱24h浸透，60℃烤箱聚合48h，制备50nm超薄切片，醋酸双氧铀、柠檬酸铅双染色，供透射电镜、免疫荧光电镜观察；③另一侧股骨头分离提取骨细胞、成骨细胞，-80℃冰箱保存，进行MAP1LC3的mRNA与蛋白表达、自噬型细胞死亡检测；/n步骤三、光镜下组织形态学观察；/n1)取一洁净的小烧杯，并依次向里面加入一侧股骨头组织、10％EDTA脱钙液，并在液面上加一层液体石蜡，同时在小烧杯上加盖，然后放入微波炉中，调节微波温度为40℃～60℃间歇脱钙，1分钟/1次，即一个循环，每次循环结束后将烧杯放到室温冷却15分钟，并更换新液，脱钙时间为1分钟×20次/24小时×7次，以大头针能够刺进骨密质为完成脱钙标准；/n2)一侧股骨头经4％多聚甲醛溶液固定24h后，经各级乙醇脱水后用石蜡包埋，然后将石蜡包埋组织快制成厚4μm切片；/n3)将制成的切片按以后步骤进行染色并采用中性树胶封片；/n4)将中性树胶封片后的切片分别用100倍及400倍光学显微镜观察，激素性股骨头坏死判定标准是以股骨头软骨下区空缺骨陷窝率作为激素性股骨头坏死的组织学判定指标；用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化；/n步骤四、投射电镜观察：/n取5％戊二醛固定的股骨头组织，首先在股骨头软骨下切取长、宽、厚度各1-2mm大小组织，然后放入5％硝酸脱钙，脱钙时间2-3h，后用1％四氧化锇固定，固定时间1-2h，随后用梯度酒精脱水，再用环氧树脂包埋，然后用1份的包埋剂与1份的无水乙醇置换无水乙醇，再依次用2份的包埋剂与1份在无水乙醇替换，最后用3份的包埋剂与1份的无水乙醇替换，然后包埋，然后放入37℃恒温箱24h，再放入60℃烤箱48h，然后用超薄切片机制备50nm超薄切片，并用醋酸双氧铀+柠檬酸铅双染色；将上述超薄切片置于电子显微镜下观察；/n步骤五、RT-PCR检测细胞内LC3 mRNA水平/n1)细胞mRNA的提取/n2)引物设计：/nMAP1LC3的基因序列为：/n上游：5’-GATGTCCGACTTATTCGAGAGC-3’/n下游：5’-TTGAGCTGTAAGCGCCTTCTA-3’,/n扩增片段大小为363bp/n内参β-Actin的基因序列为：/n上游：5’-ACTCGTCATACTCCTGCT-3’，/n下游：5’-GAAACTACCTTCAACTC-3’，/n扩增片段大小为132bp；/n3)将mRNA逆转录成cDNA；/n4)mRNA的荧光定量PCR；/n步骤六、Western Blot鉴定蛋白表达量/n1)组织总蛋白的提取；/n2)SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS-PAGE；/n3)转膜和免疫发光过程；/n步骤七、免疫荧光染色；/n步骤八、统计处理：/n应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，实验数据以
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- 王开宇 - 福州福瑞医学检验实验室有限公司
- 2019-11-05 - 2020-02-04 - C12Q1/6883
- 本发明涉及一种通过靶向高通量测序技术检测诊断青少年发病的成人型糖尿病致病基因的DNA文库及其应用，该文库包括14个青少年发病的成人型糖尿病的致病基因。本发明优选14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因，设计探针池，建立针对14个青少年发病的成人型糖尿病致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的14个基因为目前已知的青少年发病的成人型糖尿病1型至14型的致病基因，对青少年发病的成人型糖尿病的诊断、鉴别诊断和精准治疗有着重要的意义和临床价值。
- 一种用于检测基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法-201911002140.1
- 徐瑶;宋如晦;石伟林;代洋;许娜;廖兴华;张同存 - 武汉科技大学
- 2017-04-21 - 2020-01-31 - C12Q1/6883
- 本发明公开了一种用于检测基因CREB1单核苷酸多态性的PCR‑RFLP方法，首先，根据DNA池测序结果，检测到的基因多态性包括：CREB1基因启动子区距转录起始点‑1354位T或G的单核苷酸多态性和‑1343位T或A的单核苷酸多态性。以待测样本基因组DNA为模板，以引物对P为引物，在Taq DNA聚合酶、Buffer(缓冲环境)、Mg++、dNTPs存在的情况下，PCR扩增包含多态位点的CREB1基因序列，然后将PCR产物一分为二，分别用Hha I和Xsp I限制性内切酶进行消化，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳分型。
- 一种自身炎症性单基因病检测引物组和方法-201911039162.5
- 张惠丹;戴敬;李阳;赵洪玉 - 苏州乾康基因有限公司
- 2019-10-29 - 2020-01-31 - C12Q1/6883
- 本发明公开了一种自身炎症性单基因病检测引物组和方法，将254个自身炎症性单基因病突变位点的多重PCR扩增压缩至8个孔中进行，可以在可操作性、灵敏度、节省时间、降低成本方面解决现有技术的不足，具有操作简单、检测周期短、结果直观、准确性高、检测灵敏度高等技术优势。
- 一组用于代谢性脂肪肝介导的血管性疾病的诊断的生物标记物及其应用-201911179388.5
- 陈扬;张宜;商洪才;何蓉蓉;叶丽风;左睿 - 广州中医药大学(广州中医药研究院)
- 2019-11-27 - 2020-01-31 - C12Q1/6883
- 本发明提供了一组用于代谢性脂肪肝介导的血管性疾病诊断的标志物，所述标志物包括miR‑240、miR‑197、miR‑2125、miR‑923、miR‑1796、miR‑1367、miR‑1839，其核苷酸序列为：SEQ ID No.1～7所示。通过试验验证，该7种miRNA在正常小鼠与代谢性脂肪肝介导的血管性疾病小鼠的血液中差异性表达，因此，可将其作为代谢性脂肪肝介导的血管性疾病诊断和评估的分子标志物，还可用来作为预测或评估已经存在的心血管疾病的预后进行早期干预。
- 17种miRNA检测探针和试剂盒-201510430200.5
- 陈昌华;吴诗扬 - 益善生物技术股份有限公司
- 2015-07-21 - 2020-01-31 - C12Q1/6883
- 本发明涉及一种17种miRNA检测探针和包括上述检测探针的miRNA检测试剂盒，所述检测探针包括有杂交探针：其5'端为tag标签序列，3'端为结合序列，所述tag标签序列和所述结合序列之间还设有待检测靶标miRNA反向互补序列；所述tag标签序列选自SEQ ID NO.20—SEQ ID NO.38；所述待检测靶标miRNA反向互补序列选自SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.17；信号探针：其5'端为信号序列，3'端为polyT或oligoTGG。本发明所设计的各种检测探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合，特异性好、信噪比高。
- 用于检测AGTR1基因的A1166C多态性位点的核酸、试剂盒及方法-201611054344.6
- 周艳琳;邹芳;段卫涛;赵平锋 - 武汉海吉力生物科技有限公司
- 2016-11-25 - 2020-01-31 - C12Q1/6883
- 本发明公开了本发明提供了一组用于快速检测AGTR1基因的A1166C多态性位点的核酸，同时建立了一种比较高效、灵敏的AGTR1基因的A1166C多态性位点的检测试剂盒及快速检测方法。其检测试剂盒，使用方便，操作简便，自动化程度高，大大简化了操作过程，并减少了在操作过程的污染，检测效果好，具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度的特点。提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号值的获得检测的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。
- IVF-ET相关微小RNA及其应用-201810778390.3
- 张璇;杨菁;王健;兖娜娜;顾文文;孟楠;甄兴兴 - 上海市计划生育科学研究所;武汉大学人民医院
- 2018-07-16 - 2020-01-24 - C12Q1/6883
- 本发明提供了涉及IVF‑ET相关微小RNA及其应用。具体地，本发明提供了miRNA或其检测试剂的用途，用于制备判断体外受精‑胚胎移植(IVF‑ET，in vitro fertilization and embryo transfer)妊娠结局的试剂盒。本发明提供本领域急需能够用于IVF‑ET胚胎移植后早期妊娠结局的鉴别和预测的生物标志分子。
- 一种检测诊断多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因的DNA文库及其应用-201911005321.X
- 王开宇;赵烨;陈志伟 - 福州福瑞医学检验实验室有限公司
- 2019-10-22 - 2020-01-24 - C12Q1/6883
- 本发明涉及一种检测诊断多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因的DNA文库及其应用，该文库包括51个多发性牛奶咖啡斑相关疾病的致病基因。本发明优选51个多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因，设计探针池，建立针对51个多发性牛奶咖啡斑致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据，具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的51个基因检测区域能够检测遗传性色素异常、Cowden综合征、共济失调性毛细血管扩张症、Noonan综合征等多种多发性牛奶咖啡斑相关疾病，对多发性牛奶咖啡斑的病因分析和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。
- 肝肺综合征筛查的长链非编码RNA及其应用-201911178446.2
- 杨从文;鲁开智;易斌;刘静 - 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
- 2019-11-27 - 2020-01-24 - C12Q1/6883
- 本发明公开了肝肺综合征筛查的长链非编码RNA及其应用，长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该lncRNA在HPS病人肝脏大量合成，并以外泌体的形式经血液，分泌到肺，诱导了肺部炎症，肺微血管新生，进而影响肺血管扩张，导致患者呼吸困难等典型的HPS症状。因此可通过检测患者血液外泌体中lncRNA的含量，用于临床上高效地筛选出HPS患者。
- 专利分类
