[发明专利]一种诱导汗腺功能性修复的方法在审
| 申请号： | 201910895337.6 | 申请日： | 2019-09-20 |
| 公开（公告）号： | CN110684802A | 公开（公告）日： | 2020-01-14 |
| 发明（设计）人： | 孙晓艳;陈润开;付小兵;黄瑾 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军总医院 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N15/90;C12N15/12;C12N5/10 |
| 代理公司： | 11319 北京润泽恒知识产权代理有限公司 | 代理人： | 莎日娜 |
| 地址： | 100853*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | 本发明提供了一种诱导汗腺功能性修复的方法，包括：设计EDA启动子序列，构建pGLV‑H1‑GFP‑EDA sgRNA质粒；获取pHAGE‑TRE‑dCas9‑VP64质粒；利用慢病毒分别对上述两种质粒进行包装；利用上述两种慢病毒包装的质粒依次转染获取的基底层表皮角质细胞，获得稳定过表达EDA基因的细胞株；利用含强力霉素的培养基培养细胞株为汗腺样细胞；在基质胶环境下，利用含强力霉素的培养基培养汗腺样细胞形成类汗腺原基；将类汗腺原基移植至汗腺丧失区，利用强力霉素诱导形成再生汗腺。本发明应用CRISPR/dCas9技术在基因水平上对基底层表皮角质细胞进行编辑修饰，提高了汗腺重编程的效率；同时以基质胶为支架联合汗腺特异性培养基，诱导表皮角质细胞形成类汗腺原基，促进了体内汗腺从组织结构到生理功能的修复。 | ||
| 搜索关键词： | 汗腺 表皮角质细胞 强力霉素 原基 质粒 诱导 基底层 基质胶 慢病毒 培养基培养细胞 特异性培养基 功能性修复 培养基培养 启动子序列 基因水平 生理功能 细胞形成 组织结构 细胞株 重编程 构建 支架 转染 修饰 种质 体内 细胞 修复 移植 再生 基因 应用 联合 | ||
【主权项】：
1.一种诱导汗腺功能性修复的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n设计EDA启动子序列，构建pGLV-H1-GFP-EDA sgRNA质粒；/n获取pHAGE TRE dCas9-VP64质粒；/n利用慢病毒分别对pGLV-H1-GFP-EDA sgRNA质粒和pHAGE TRE dCas9-VP64质粒进行包装；/n获取基底层表皮角质细胞；/n利用慢病毒包装的pGLV-H1-GFP-EDA sgRNA质粒及慢病毒包装的pHAGE-TRE-dCas9-VP64质粒依次转染所述表皮角质细胞，并进行EDA基因鉴定，获得稳定过表达EDA基因的细胞株；/n利用具有强力霉素的汗腺培养基培养所述细胞株，诱导其体外重编程为汗腺样细胞；/n在基质胶环境下，利用具有强力霉素的汗腺培养基培养所述汗腺样细胞，诱导形成类汗腺原基；/n将所述类汗腺原基移植至汗腺丧失区，并利用强力霉素诱导形成再生汗腺。/n
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- 秦晓东;何祥一;曾飒;张志东 - 中国农业科学院兰州兽医研究所
- 2019-08-09 - 2019-11-26 - C12N15/867
- 本发明公开了外源性人端粒酶反转录酶基因重组慢病毒颗粒的获得方法，具体涉及生物技术领域，包括以下步骤：S1、准备材料和试剂；S2、构建pLVX‑puro‑hTERT重组慢病毒载体；S3、表达hTERT基因重组慢病毒颗粒的获得。本发明通过携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，慢病毒载体能够将目的基因高效整合于宿主基因组，从而实现外源基因长期、稳定的表达，整个慢病毒颗粒获取操作方便，获取的慢病毒颗粒对于后期的感染细胞，使正常体细胞永生化得到保证，可获得稳定增殖的永生化细胞系，并且侵染效率高，稳定性较好。
- 一种肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体及其构建方法-201810362418.5
- 刘建军;任晓虎;阮嘉雯;刘威;黄新凤 - 深圳市疾病预防控制中心(深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所)
- 2018-04-20 - 2019-11-26 - C12N15/867
- 本发明提供一种肝细胞miR‑199b低表达的慢病毒表达载体，包括pLVX‑shRNA2‑puro病毒载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和tudmiRNA‑199b重组质粒；所述多克隆位点序列包括Hind III酶切位点和BamH I酶切位点，所述tudmiRNA‑199b重组质粒正向插入所述多克隆位点序列中。本发明属于基因工程技术领域，本发明提供的重组慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少的优点，可在人源肝细胞中持续、高效、稳定地抑制miRNA‑199b表达。
- 一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法及应用-201610933594.0
- 刘明录;万磊;李言志;冯健海;金海峰;强邦明;张传鹏 - 山东兴瑞生物科技有限公司
- 2016-10-25 - 2019-11-22 - C12N15/867
- 本发明公开了一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法及应用，编码嵌合抗原受体scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ的融合基因片段，将所述融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ编码基因的慢病毒，将所述携带scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK，该嵌合抗原受体scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ]修饰的CIK可用于B细胞淋巴瘤白血病的治疗。
- 一种基于OCTS技术的胰腺癌、恶性间皮瘤CAR-T治疗载体及其构建方法和应用-201710390649.2
- 祁伟;俞磊;康立清;林高武;余宙 - 上海优卡迪生物医药科技有限公司
- 2017-05-27 - 2019-11-22 - C12N15/867
- 本发明公开了一种基于OCTS技术的胰腺癌、恶性间皮瘤CAR‑T治疗载体，包括慢病毒骨架质粒、人EF1α启动子(SEQ ID NO.14)、OCTS嵌合受体结构域和PDL1单链抗体；OCTS嵌合受体结构域包括：CD8 leader嵌合受体信号肽(SEQ ID NO.15)、PDL1单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.16)、PDL1单链抗体重链VH(SEQ ID NO.17)、MESOTHELIN单链抗体轻链VL(SEQ ID NO.18)、MESOTHELIN单链抗体重链VH(SEQ ID NO.19)、抗体内铰链Inner‑Linker(SEQ ID NO.20)、单链抗体间铰链Inter‑Linker(SEQ ID NO.21)、CD8 Hinge嵌合受体铰链(SEQ ID NO.22)、CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区(SEQ ID NO.23)、TCR嵌合受体T细胞激活域(SEQ ID NO.26)以及嵌合受体共刺激因子区域。此外，本发明还公开了该载体的构建方法及其在制备治疗胰腺癌、恶性间皮瘤的药物中的应用。
- 一种乳腺癌骨转移小鼠模型造模方法-201910829779.0
- 韩倩倩;王白燕;高剑峰;李宁;杨联河;姜乃菡 - 河南中医药大学
- 2019-09-03 - 2019-11-22 - C12N15/867
- 本发明涉及一种乳腺癌骨转移小鼠模型造模方法。该方法包括以下步骤：取小鼠，将用于诱导小鼠乳腺癌的慢病毒制剂对小鼠进行乳头注射，将乳头注射过慢病毒的小鼠以血液注射的形式注射用于诱导小鼠乳腺癌的慢病毒制剂若干次。首先使用用于诱导小鼠乳腺癌的慢病毒制剂对小鼠进行乳头注射，使得小鼠产生原发肿瘤。之后将用于诱导小鼠乳腺癌的慢病毒制剂对小鼠进行血液注射，诱导原发肿瘤细胞向血液中移动，促使其形成骨转移状态。可促使小鼠的原发乳腺癌成功转移至目标位点。
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