[发明专利]一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法

权利要求书

1.一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，其特征在于：依次包括以下步骤：

A、利用MS培养基培养诱导小麦胚性愈伤组织；

B、采用液体MS培养基培养制备小麦悬浮单细胞群；

C、利用固体MS培养基制备小麦单细胞固定化载体；

D、采用⁶⁰钴γ-射线或高能电子加速器高能电子束对小麦单细胞固定化载体进行辐照诱变；

E、对辐照诱变后的小麦单细胞固定化载体进行抗性筛选；

F、将小麦单细胞固定化载体上经过抗性筛选存活的诱变单细胞通过组织培养获得再生株系，筛选得到小麦固定化单细胞定向诱变的新种质。

2.根据权利要求1所述的一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，其特征在于：所述诱导小麦胚性愈伤组织所用的MS培养基为添加有3mg/L2,4-D、0.1mg/L KT、40g/L蔗糖、10g/L琼脂的MS培养基，pH为5.8。

3.根据权利要求1所述的一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，其特征在于：所述培养制备小麦悬浮单细胞群所用的液体MS培养基为添加有4.5mg/L 2,4-D、0.2mg/L KT、50g/L蔗糖的液体MS培养基，pH为5.8。

4.根据权利要求1所述的一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，其特征在于：所述固体MS培养基为添加有3mg/L 2,4-D、0.1mg/L KT、50g/L蔗糖、15g/L琼脂的MS培养基，pH为5.8。

5.根据权利要求1所述的一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，其特征在于：所述培养诱导小麦胚性愈伤组织和培养制备小麦悬浮单细胞群包括以下过程：

将发芽小麦种子分别用70％酒精、0.1mol/L次氯酸钠消毒、去壳、切胚，将切下的胚置于培养诱导小麦胚性愈伤组织的MS培养基上，25℃培养，得到直径达3mm的小麦愈伤组织；

取上述直径达3mm的小麦愈伤组织接种于培养制备小麦悬浮单细胞群的液体MS培养基中，接种后的液体MS培养基进行超声振荡处理20min，然后振荡速度为100rpm，25℃进行震荡培养，得到小麦悬浮单细胞群。

6.根据权利要求1所述的一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，其特征在于：利用固体MS培养基制备小麦单细胞固定化载体包括以下过程：

将固体MS培养基各组分充分混合，加热至琼脂完全溶解，在无菌条件下冷却至50℃，加入已过滤除去液体培育基的小麦悬浮单细胞群搅拌均匀包埋；包埋后趁热倒入培养皿中，液面高度0.5cm，待冷却凝固，用打孔器制成直径0.5cm的小麦单细胞固定化载体。

7.根据权利要求1所述的一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，其特征在于：所述采用60钴γ-射线对小麦单细胞固定化载体进行辐照诱变是采用⁶⁰钴γ-射线对小麦单细胞固定化载体进行辐照剂量为20Gy～300Gy、剂量率为10Gy/min的辐照诱变；

所述采用高能电子加速器高能电子束对小麦单细胞固定化载体进行辐照诱变是采用10MeV/20kW高能电子加速器高能电子束对小麦单细胞固定化载体进行辐照剂量为20Gy～300Gy、剂量率为10Gy/min的辐照诱变。

8.根据权利要求1所述的一种小麦固定化单细胞定向诱变的技术方法，其特征在于：所述抗性筛选是将辐照诱变后的小麦单细胞固定化载体置于40℃高温、0℃低温、相对湿度10％干旱、50mM NaCl盐胁迫的一种或两种以上组合环境中处置72小时。