[发明专利]一种抑制素基因工程调控抗原的制备方法无效
| 申请号： | 200810218477.1 | 申请日： | 2008-10-21 |
| 公开（公告）号： | CN101423833A | 公开（公告）日： | 2009-05-06 |
| 发明（设计）人： | 施振旦;黎敏义;刘颖 | 申请（专利权）人： | 华南农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/12 | 分类号： | C12N15/12;C12N15/70;C07K19/00;C07K14/47;A61K39/00;A61P15/08 |
| 代理公司： | 广州粤高专利代理有限公司 | 代理人： | 林丽明;任 重 |
| 地址： | 510642广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 抑制 基因工程 调控 抗原 制备 方法 | ||
【说明书】：
技术领域
本发明属于动物生产性状调控物质技术领域，特别涉及一种抑制素基因工程调控抗原的制备方法。
背景技术
目前的畜牧业在集约化和产业化发展过程中，由于在遗传育种技术、饲料配合技术、疫病防治技术、环境卫生技术和现代企业经营管理技术的应用，使畜牧业的生产效率得到了极大的提高。但各生产环节中，动物的繁殖性能在过去几十年却没有提高。在家畜中除猪外，绝大部分的牛和羊等动物在发情时仅排一枚卵而只能产一仔，在生产一头肉用动物的同时必须同时供养一头种母畜，致使肉牛业和肉羊业的生产成本居高不下，生产效率和经济效益的提高受到极度限制。目前，如何提高产仔数和得到更多的优良胚胎一直是畜牧生产和畜牧研究所追求的目标。
产仔数少和在胚胎移植过程中得到可利用胚胎少是由于卵泡分泌的卵泡抑制素，抑制垂体分泌FSH，小卵泡不能正常生长，在自然条件下卵巢只能排出一个卵子，牛羊出现单胎。而在超排时也由于大剂量的注射FSH导致排出的卵利用率很低。
目前用于提高产仔数和得到更多的优良胚胎的方法可以通过两种方法：使用药物和内分泌免疫调控。使用常规药物是家畜注射FSH或FSH类似的药物，拮抗抑制素发挥作用，根据目前的结果：在超排过程中得到的胚胎利用率很低，已经没有发掘的潜力。而通过内分泌免疫调控则可以获得更多的可利用胚胎，在动物的卵泡发育过程中，卵泡颗粒细胞在未表达FSH受体之前对FSH无反应，其分裂增殖和功能发育受到卵泡分泌的另一旁分泌因子活化素(Activin)的促进。活化素具有促进FSH分泌的作用，同时也是抑制素拮抗的激素。在免疫抑制素促进垂体分泌FSH的同时，也将解除抑制素对卵泡颗粒细胞表面活化素受体的拮抗作用，从而促进小卵泡发育使其表面具有FSH受体并成为对FSH具有反应的卵泡。因此在免疫抑制素的基础再使用FSH进行超数排卵，这些原本未能发育的卵泡也将能够继续发育出来，并最后成熟排卵，在母畜配种后产生比普通的超排处理更多的胚胎。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种成本低、工艺简单的抑制素基因工程调控抗原的制备方法，所述抑制素基因工程调控抗原用于提高动物排卵数、产仔数和胚胎产量。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
提供一种抑制素基因工程调控抗原的制备方法，包括下述步骤：
(1)克隆抑制素编码基因；
(2)利用抑制素编码基因，制备抑制素的重组融合蛋白；
(3)利用该抑制素重组融合蛋白制备抑制素的基因工程调控抗原。
步骤(1)所述克隆抑制素编码基因包括以下步骤：
(a)根据Genbank中发表的猪抑制素亚基基因序列(Genbank号：NM_214189)，设计特异性上游引物I1和下游引物I2；
(b)采取异硫氰酸胍-氯仿-异丙醇方法从蓝塘猪卵巢组织中提取总基因组RNA，通过反转录得到cDNA；
可取蓝塘猪卵巢组织，置于1ml异硫氰酸胍苯酚溶液(Trizol液，购于Invitrogen公司)中匀浆，然后用氯仿去除蛋白质，离心15分钟后取出上清液，向上清液中加入异丙醇再离心沉淀总基因组RNA。把总RNA配成1g/L的浓度溶于含DEPC的水中，通过反转录(RT)得到cDNA。
(c)用引物I1、I2、dNTP和反转录合成cDNA作为模板，在DNA聚合酶的催化下通过PCR反应扩增得到一条长度为1095bp的特异性条带，即猪抑制素的编码cDNA片段。
步骤(a)所述上游引物I1和下游引物I2为：
I1：5’-ATGTGGCCTCAGCTGCTCCTCTTGC-3’；
I2：5’-TTAGATGCAGGCACAGTGCTGGGTG-3’。
步骤(2)所述制备抑制素的重组融合蛋白是指利用IPTG诱导大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株表达制备重组融合蛋白；包括以下步骤：
(d)根据抑制素成熟肽的cDNA碱基序列和大肠杆菌表达质粒pRSET A的多克隆位点碱基序列，设计合成上游引物Mf和下游引物Mr；
(e)利用所述引物Mf、Mr以及上述反转录扩增得到的抑制素的编码cDNA序列为模板，通过PCR反应扩增出抑制素成熟肽的cDNA克隆片段；
(f)所述抑制素成熟肽的cDNA克隆片段经过Bgl II和EcoR I双酶切后，克隆到表达质粒pRSET A的Bgl II和EcoRI两酶切位点之间，构建成重组表达质粒pInhibin SCAU；
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- 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及猪C1QTNF3基因过表达载体质粒的构建方法及其表达水平的检测。本发明提供了序列如SEQ ID NO:1‑2所示的用于构建猪C1QTNF3基因过表达载体质粒的引物，以及猪C1QTNF3基因过表达载体质粒的构建方法；本发明还提供了序列如SEQ ID NO:3‑4所示的用于检测猪C1QTNF3基因表达水平的引物，以及检测猪C1QTNF3基因表达水平的方法。本发明为猪C1QTNF3基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。
- 转录后水平低氧调控基因、应用及其调控方法-201910576041.8
- 张军峰;徐曦;徐浩;祁存芳;张建水;杨蓬勃;苏兴利;史利利;张力;庞龙 - 西安医学院
- 2019-06-28 - 2019-09-20 - C12N15/12
- 本发明公开了转转录后水平低氧调控基因、应用及其调控方法，转录后水平低氧调控基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，转录后水平低氧调控基因的用途，用于低氧靶向调控治疗基因转录后水平的表达；转录后水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法，本发明可以对低氧调控基因在常氧条件下或者正常组织中低表达甚至不表达，而在低氧条件下或者缺血组织中表达上调，进而在实现有效的治疗的同时，避免或者降低治疗基因过表达可能引起的不良副作用的风险。
- 翻译后水平低氧调控基因、应用及其调控方法-201910576045.6
- 张军峰;祁存芳;徐曦;张建水;苏兴利;赵朝华;徐浩;庞龙;史利利;计胜峰 - 西安医学院
- 2019-06-28 - 2019-09-20 - C12N15/12
- 本发明公开了翻译后水平低氧调控基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；翻译后水平低氧调控基因的用途，用于低氧靶向调控治疗基因的表达；一种翻译后水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法；本发明可以对低氧调控基因在常氧条件下或者正常组织中低表达甚至不表达，而在低氧条件下或者缺血组织中表达上调，进而在实现有效的治疗的同时，避免或者降低治疗基因过表达可能引起的不良副作用的风险。
- 家蚕Bmhsp19.9基因在培育对极端温度耐受的家蚕品种中的应用-201910592447.5
- 蒋亮;王玉梅;郭慧珍;夏庆友 - 西南大学
- 2019-07-03 - 2019-09-20 - C12N15/12
- 本发明公开了家蚕Bmhsp19.9基因在培育对极端温度耐受的家蚕品种中的应用，家蚕Bmhsp19.9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，通过在细胞水平和转基因家蚕水平增量表达家蚕Bmhsp19.9基因，能够提高细胞和转基因家蚕在高温胁迫下的存活率，同时能够提高转基因家蚕在低温环境下的生长速度，因此Bmhsp19.9基因是一个影响家蚕对极端环境温度耐受力的关键基因，可为家蚕转基因抗性品种的培育提供理论基础和靶标基因；本发明还提供了家蚕Bmhsp19.9基因的启动子，可以在极端温度下调控下游基因的表达。
- 转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因、应用及其调控方法-201910574989.X
- 张军峰;徐曦;祁存芳;张建水;苏兴利;赵朝华;徐浩;张力;庞龙;魏亮 - 西安医学院
- 2019-06-28 - 2019-09-17 - C12N15/12
- 本发明公开了转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因、应用及其调控方法，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因的用途，用于低氧靶向调控治疗基因的表达；一种转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法；本发明可以对低氧调控基因在常氧条件下或者正常组织中低表达甚至不表达，而在低氧条件下或者缺血组织中表达上调，进而在实现有效的治疗的同时，避免或者降低治疗基因过表达可能引起的不良副作用的风险。
- 基因突变体及其应用-201410012067.7
- 阴正勤;金鑫;孟晓红;黎其友;徐海伟 - 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院;中国人民解放军总医院
- 2014-01-10 - 2019-09-17 - C12N15/12
- 本发明公开了分离的核酸、分离的多肽、筛选易感常染色体隐性遗传视网膜色素变性疾病的生物样品的方法、筛选易感常染色体隐性遗传视网膜色素变性疾病的生物样品的系统、用于筛选易感常染色体隐性遗传视网膜色素变性疾病的生物样品的试剂盒、构建体及重组细胞。其中，分离的编码ABCA4的核酸，与SEQ ID NO：1相比具有c.1924T>A突变，或者分离的编码CNGA1的核酸与SEQ ID NO：3相比具有c.472delC突变，或者c.1744G>A突变。通过检测这些突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感常染色体隐性遗传视网膜色素变性疾病。
- 专利分类
