[发明专利]一种蛋白修饰的方法在审
| 申请号： | 201910624363.5 | 申请日： | 2019-07-11 |
| 公开（公告）号： | CN110468173A | 公开（公告）日： | 2019-11-19 |
| 发明（设计）人： | 熊海;肖秋芸;赵烜 | 申请（专利权）人： | 深圳大学 |
| 主分类号： | C12P21/02 | 分类号： | C12P21/02;C07K14/47 |
| 代理公司： | 44268 深圳市君胜知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 王永文;刘芙蓉<国际申请>=<国际公布> |
| 地址： | 518060 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 非天然氨基酸 目标蛋白基因 密码子 修饰 蛋白表达系统 体外蛋白翻译 编码氨基酸 密码子突变 蛋白产物 蛋白片段 蛋白修饰 目标蛋白 同一体系 预组装 构建 制备 转运 突变 蛋白 合成 | ||
【权利要求书】：
1.一种蛋白修饰的方法，其特征在于，包括步骤：
A、提供包含目标蛋白基因序列的载体，对所述目标蛋白基因序列中的编码氨基酸的密码子进行突变；
B、对天然氨基酸进行修饰，构建非天然氨基酸；
C、分别制备Flexizyme和tRNAsep；
D、构建体外酯化反应体系，利用上述Flexizyme将非天然氨基酸与上述tRNAsep进行连接，获得ThioAcX-tRNA酯化产物，其中X为任意氨基酸；
E、将上述ThioAcX-tRNA和经密码子突变的目标蛋白加入PURE EXPRESS蛋白表达系统进行反应，获得修饰后的蛋白产物。
2.根据权利要求1所述的蛋白修饰的方法，其特征在于，所述载体为pUC19载体，所述pUC19载体含有5’-UTR序列和3’-UTR序列，其中：
5’-UTR序列:
5’-GCGAATTAATACGACTCACTATAGGGCTTAAGTATAAGGAGGAAAA；
3’-UTR序列:
5’-AAACCCCTCCGTTTAGAGAGGGGTTATGCTAGTTA-3’。
3.根据权利要求1所述的蛋白修饰的方法，其特征在于，步骤B包括：对天然赖氨酸的ε位氨基进行乙酰化修饰，用3，5二硝基苯保护羧基，得到非天然赖氨酸。
4.根据权利要求1所述的蛋白修饰的方法，其特征在于，步骤C包括：分别将含有tRNAsep和Flexizyme序列的载体经末端酶切分别线性化，作为模板，在T7 RNA polymerase作用下进行体外转录，将得到的RNA经变性PAGE纯化，分别得到tRNAsep和Flexizyme。
5.根据权利要求1所述的蛋白修饰的方法，其特征在于，步骤A中，所述目标蛋白为人体组蛋白H3或人体组蛋白H4。
6.根据权利要求1所述的蛋白修饰的方法，其特征在于，步骤E之后，还包括步骤：
F、通过Western-免疫印迹法和高效液相-质谱联用仪对修饰后的蛋白产物进行表征。
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